成纤维细胞分离方法
1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外- -组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出，后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS,再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另- -装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。ES细胞具有的这种能力在体外增殖并保持未分化状态及其多向分化潜能的生物学特性,使其广泛应用于生物学研究的各个领域,它的潜在医学应用价值已成为世界范围内研究的热点。
3. 用200 μ的移液反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4C 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37C水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(- -般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
7. 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者- -般不超过五分钟)，按1:5传代。
9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右， 将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。
细胞培养中常见的污染及解决方法
霉菌污染
正常情况下，培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天，在倒置显微镜下仍保持透明，无杂质。一旦出现絮状杂质，显微镜下可见丝状和团块状漂浮物，菌丝明显。此时，虽然细胞仍在生长，但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。
解决方法：用硫酸铜溶液擦拭 CO2 培养箱，向托盘中加入饱和硫酸铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液，避免霉菌污染。
如果霉菌污染，暂时转移所有细胞，并立即使用 guo 氧擦拭培养箱，包括层板和内壁。将 guo 氧放在培养箱中一小时，使蒸汽扩散，待 guo 氧气味消散后，将细胞转移到培养箱中。CellCountingKit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。值得注意的是，培养箱需要每两个月定期清洗一次，尤其是在梅雨季节。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精连续擦拭培养箱，用紫外线照射也是一种有效的方法。
为防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang
线菌素 D 或青链。一旦被污染，就不可能恢复，即使使用上述，也没有什么区别。(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0。对于支原体污染的细胞培养，选择是丢弃污染的培养物，并用使用新鲜的无支原体的储存液，消毒环境。如果所有的细胞都被污染了，那可能是整个培养系统污染了。因此，必须对培养基和实验设备进行检查。如果只是个别污染，可能是操作问题，有必要注意实验操作步骤的规范。
Q:如何避免中沉淀物的出现？
A:首先要注意正确的解冻步骤，而且溶解过程中一定要每隔一段时间均匀而缓慢的摇动。我们已经发现在下列情况下沉淀物可能增加，使用中应该尽量避免：
（1）热灭活；
（2）在 37℃ 下培养；
（3）反复冻融；
（4）γ 射线照射；
（5）长期储存在 2-8℃；
（6）在室温下放置时间过长
Q:如何去除中的沉淀？
A:如想去除这些絮状沉淀物，可以将分装到无菌离心管中，以400g离心，上清液即可直接加入到培养基 内一起过滤。
注意：不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物，因为这可能阻塞滤膜。
2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]：
(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时，使其达到 50～60% 板底面积。
(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下：
①在 1 mL 无 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。
②旋转 1 秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。
③室温下放置 5～10 分钟，使 DNA 结合在脂质体上。
(3) 弃去细胞中的旧液，用 1 mL 无 DMEM 洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物，37℃ 培养 3～5 小时。
(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，继续培养 14～24 小时，
(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培养 24～48 小时。
(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
3、稳定的脂质体转染方法如下：
(1) 接种细胞同前，细胞长至 50% 板底面积可用于转染。
(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。
(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，37℃ 培养 48 小时。
(4) 吸出 DMEM，用 G418 选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染，方法参照细胞筛选法进行。
